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                    新聞動態
                    Northern Blot原理及實驗方法
                    發布于:2011-01-27 0:26:13 點擊次數:6132次  

                    實驗方法:
                    [儀器、試劑、材料]
                    (一)儀器
                    恒溫水浴箱,電泳儀,凝膠成像系統,真空轉移儀,真空泵,UV 交聯儀,雜交爐,恒溫搖床,脫色搖床,漩渦振蕩器,分光光度計,微量移液器,電爐(或微波爐),離心管,燒杯,量筒,三角瓶,等。
                    (二)材料
                    總RNA樣品或mRNA樣品,探針模板DNA(25 ng),尼龍膜
                    (三)試劑
                    NorthernMax Kit(Cat. # 1940,Ambion, Inc.),瓊脂糖,DEPC, X光底片,底片暗盒,Random Primer, dNTP Mixture,111 TBq/mmol[a-32P]dCTP,Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS,雙氧水, 滅菌水等。

                    [方法與步驟]
                    1. 用具的準備:
                    180度烤器皿:三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時。
                    電泳槽:清洗梳子和電泳槽,并用雙氧水浸泡過夜,用DEPC水沖洗,干燥備用。
                    處理DEPC水(2 L)備用。

                    2.用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染
                    用RNAZap擦洗梳子,電泳槽,刀片等,然后用DEPC水沖洗二次,去除RNAZap。

                    3.制膠:
                    1. 稱取0.36mg 瓊脂糖加入三角錐瓶中,加入32.4mlDEPC水后,微波爐加熱至瓊脂糖完全熔解。60℃空氣浴平衡溶液 (需加DEPC水補充蒸發的水分)
                    2. 在通風廚中加入3.6ml的10*Denaturing Gel buffer,輕輕振蕩混勻。
                    注意盡量避免產生氣泡。
                    3. 將熔膠倒入制膠板中,插上梳子
                    如果膠溶液上存在氣泡,可以用熱的玻璃棒或其它方法去除,或將氣泡推到膠的邊緣。注:膠的厚度不能超過0.5cm。
                    4.膠在室溫下完全凝固后,將膠轉移到電泳槽中,加入1x MOPS Gel Running buffer蓋過膠面約1cm,小心拔出梳子。(配制250ml 1*MOPS Gel Running buffer,在電泳過程中補充蒸發的buffer。)
                    5.檢查點樣孔。

                    4. RNA樣品的制備
                    在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當的EB(終濃度為10ug/ml);靹蚝,65℃空氣浴15min。短暫低速離心后,立即放置于冰上5min。

                    5. 電泳:
                    1. 將RNA樣品小心加到點樣孔中。
                    2. 在5V/cm下跑膠(5x14cm)。在電泳過程中,每隔30min短暫停止電泳,取出膠,混勻兩極的電泳液后繼續電泳。當膠中的溴紛藍(500bp)接近膠的邊緣時終止電泳。
                    3. 紫外燈下,檢驗電泳情況,并用尺子測量18S、28S、溴紛藍到點樣孔的距離。
                    注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時間。

                    6. 轉膜
                    1.用3%雙氧水浸泡真空轉移儀后,用DEPC水沖洗。
                    2.用RNAZap擦洗多孔滲水屏和塑膠屏,用DEPC水沖洗二次。
                    3.連接真空泵和真空轉移儀,剪取一塊適當大小的膜(膜的四邊緣應大于塑膠屏孔口的5mm),膜在Transfer buffer浸濕5分鐘后,放置在多孔滲水屏的適當位置。
                    4.蓋上塑膠屏,蓋上外框,扣上鎖。
                    5.將膠的多余部分切除,切后的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔,并至少蓋過邊緣約2mm,以防止漏氣。
                    6.將膠小心放置在膜的上面,膜與膠之間不能有氣泡。
                    7.打開真空泵,使壓強維持在50~58mbar;立即將transfer buffer加到膠面和四周。每隔10min在膠面加上1ml transfer buffer,真空轉移2小時。
                    8.轉膜后,用鑷子夾住膜,于1x MOPS Gel Running buffer中輕輕泡洗10秒,去除殘余的膠和鹽。
                    9.用吸水紙吸取膜上多余的液體后,將膜置于UV交聯儀中自動交聯。
                    10.將膠和紫外交聯后的膜,在紫外燈下檢測轉移效率。(避免太長的紫外曝光時間)
                    12.將膜在-20℃保存。
                    7. 探針的制備
                    1.在1.5ml離心管中配制以下反應液:
                    模板DNA(25 ng)     1ul
                    Random Primer 2ul
                    滅菌水 11ul
                    總體積:14ul
                    2.95°C加熱3分鐘后,迅速放置于冰冷卻5min。
                    3.在離心管中按下列順序加入以下溶液:
                    10×Buffer 2.5ul
                    dNTP Mixture 2.5ul
                    111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul
                    Exo-free Klenow Fragment 1 ul
                    4.混勻后(25ul),37°C下反應30分鐘。短暫離心,收集溶液到管底。
                    5.65°C加熱5min使酶失活。
                       
                    8. 探針的純化及比活性測定:
                    1.準備凝膠:將1g凝膠加入30ml的DEPC水中,浸泡過夜。用DEPC水洗滌膨脹的凝膠數次,以除去可溶解的葡聚糖。換用新配制的TE(PH7.6)。
                    2.取1ml一次性注射器,去除內芯推捍,將注射器底部用硅化的玻璃纖維塞住,在注射器中裝填Sephadex G-50凝膠。
                    3.將注射器放入一支15ml離心管中,注射器把手架在離心管口上。1600g離心4分鐘,凝膠壓緊后,補加Sephadex G-50凝膠懸液,重復此步直至凝膠柱高度達注射器0.9ml刻度處
                    4.100ul STE緩沖液洗柱,1600g離心4min。重復3次。
                    5.倒掉離心管中的溶液后,將一去蓋的1.5ml離心管置于管中,再將裝填了Sephadex G-50凝膠的注射器插入離心管中,注射器口對準1.5ml離心管。
                    6.將標記的DNA樣品加入25 ul STE,取出0.5ul點樣于DE8 paper上,其余上樣于層析柱上。
                    7.1600g離心4min,DNA將流出被收集在去蓋的離心管中,而未摻入DNA的dNTP則保留在層析柱中。取0.5ul己純化的探針點樣于DE8-paper.
                    8. 測比活性(試劑比活要求:106cpm/ml)!

                    9.預雜交:
                    1.將預雜交液在雜交爐中68℃預熱,并漩渦使未溶解的物質溶解。
                    2.加入適當的ULRAhyb到雜交管中(以100cm2 膜面積加入10mlULRAhyb雜交液),42℃預雜交4 hr。

                    10.探針變性:
                    1.用10 mM EDTA將探針稀釋10倍。
                    2.90℃熱處理稀釋后探針10min后,立即放置于冰上5min。
                    3.短暫離心,將溶液收集到管底。

                    11.雜交:
                    1.加入0.5ml ULTRAhyb到變性的探針中,混勻后,將探針加到預雜交液中。
                    2.42℃雜交過夜(14~24hr)。
                    雜交完后,將雜交液收集起來于-20℃保存。

                    12.洗膜:
                    1.低嚴緊性洗膜:加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液),室溫下,搖動洗膜5min兩次。
                    2.高嚴緊性洗膜: 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液),42℃ 搖動洗膜20min兩次。

                    13.曝光:
                    1. 將膜從洗膜液中取出,用保鮮膜包住,以防止膜干燥。
                    2. 檢查膜上放射性強度,估計曝光時間
                    3. 將X光底片覆蓋與膜上,曝光
                    4. 沖洗X光底片,掃描記錄結果。

                    14.去除膜上的探針:將200ml 0.1%SDS(由DEPC水配制)煮沸后,將膜放入,室溫下讓SDS冷卻到室溫,取出膜,去除多余的液體,干燥后,可以保存幾個月。

                    15.雜交結果


                    操作應該小心,但不必緊張。用于RNA電泳、轉膜的所有器械、用具均須處理以除去RNAse 酶,以免樣品的降解。轉膜時,注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡
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